Larry Daley (Ben Stiller) é um homem sonhador e de bom coração que, apesar de nunca dar sorte em nada, acredita que o destino lhe reserva algo grandioso. Mas nem ele poderia imaginar o quanto isso seria "grandioso" ao aceitar o que parece ser um emprego banal como segurança do turno da noite num museu de história natural. Durante o turno de Larry, coisas fantásticas começam a acontecer: maias, gladiadores romanos e caubóis ganham vida e travam batalhas épicas; na busca pelo fogo, um homem de Neandertal incendeia sua própria vitrine; Átila, o Huno, começa a pilhar a sua ala do museu, e um Tiranossauro Rex faz todos se lembrarem por que é considerado o mais temível predador de todos os tempos. Em meio ao caos, a única pessoa a quem Larry pode recorrer é a estátua de cera do presidente Teddy Roosevelt (Robin Williams), que ajuda o nosso herói a controlar a confusão, impedir um plano nefasto e salvar o museu.